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RNA恒溫快速擴增試劑盒（基礎型）使用說明書

原理概述：

本試劑盒基于一種常溫恒溫核酸快速擴增技術：在恒溫條件下（42 °C），特殊修飾的反轉錄酶利用特異性引物DNA和模板RNA合成cDNA鏈，反應體系中的重組酶、單鏈DNA結合蛋白和DNA聚合酶以新合成的cDNA鏈為模板進行快速核酸擴增反應。適用于實驗室級別的RNA擴增以及其他檢測用途的RNA擴增使用。

產品特點：

本試劑盒具有靈敏度高、特異性強、反應時間短（僅需30 mins）等優點，反應組分為干粉狀態，操作簡便，易于保存。

本試劑對設備要求低，金屬浴、水浴鍋等即可進行反應操作，無需購買PCR擴增儀等價格高昂的專屬設備。

引物設計：

建議使用長度在 30-35 bp的引物，引物過短會影響擴增速度和檢測靈敏度；引物設計避免形成二級結構而影響擴增；擴增子長度建議在150-300 bp，通常不超過500 bp。

試劑盒組成：

試劑盒儲存：

運輸條件：低溫運輸；

儲存條件：儲存溫度 ≤ -20 oC，避光保存，避免重壓、反復凍融；

產品有效期：12個月。

操作步驟：提前30分鐘將試劑盒所需組分取出，室溫融化，震蕩混勻。

1) 每個干粉反應管加入29.4 μL A buffer（注意：A buffer需完全融化混勻，否則會對實驗效果產生影響）；

2) 每個反應管分別加入2 μL上游引物和2 μL下游引物（引物濃度10 μM，對于多個反應、步驟1和步驟2可以混合后再分裝至反應管中）；

3) 向反應管中依次加入12.1 μL ddH2O和2 μL核酸模板（可根據核酸濃度調整加入的核酸模板體積，并相應調整加入的ddH2O體積，至模板與ddH2O總體積為14.1 μL）;

4) 最后向反應管中加入2.5 μL B buffer并充分混合（對于多個反應，建議將B buffer加至反應管的蓋子內側，上下顛倒反應管8-10次混勻）；

5) 混勻后，將反應液甩（或快速離心）至管子底部，然后立即將反應管放入恒溫設備中42 oC孵育30 mins；

6) 反應結束后，加入50 μL酚/氯仿，1:1抽提反應液，12000 rpm離心5 mins，取5 μL上清進行電泳檢測。（或者使用DNA產物純化試劑盒處理反應液后進行電泳檢測）

體系配制

注意事項：

1．由于試劑盒靈敏度非常高，在進行反應時請注意避免微量核酸染，并盡量考慮設置空白對照以確認是否有核酸污染。

2．試劑盒保質期12個月。每次使用時，請取出實驗所需的MIRA反應單元的數量，置于冰浴條件下并在8小時內使用；剩余部分，請置于存儲條件下。

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