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產(chǎn)品說(shuō)明：

膠原蛋白是結(jié)締組織和內(nèi)臟器官細(xì)胞外基質(zhì)的主要構(gòu)造成分，但在皮膚、肌腱、骨骼中分布最為廣泛。從遺傳和結(jié)構(gòu)上膠原蛋白分為許多類型。膠原蛋白 I (Collagen,Type I)是由2個(gè)α1鏈和1個(gè)α2鏈組成的異源多聚體，在37°C， 中性pH下自發(fā)形成三螺旋骨架，是一種優(yōu)秀的細(xì)胞培養(yǎng)用基質(zhì)，廣泛用于肝細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、脊神經(jīng)節(jié)、肌肉細(xì)胞、施萬(wàn)細(xì)胞、胚肺細(xì)胞、上皮細(xì)胞和其他大量細(xì)胞系。 還能用于研究細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、遷移以及發(fā)育過(guò)程中的組織形態(tài)發(fā)生。

我司提供的鼠尾膠原蛋白l是根據(jù)Birkedal-Hansen方法，通過(guò)醋酸抽提、氯化鈉沉淀、磷酸氫二鈉沉淀等步驟制備。可用于包被細(xì)胞培養(yǎng)器皿，培養(yǎng)細(xì)胞表面粘附性，特別適合那些在普通培養(yǎng)器皿表面不易貼壁的細(xì)胞，比如成纖維細(xì)胞、肝細(xì)胞等原代細(xì)胞。還可用于三維膠的制備，模擬真實(shí)的生長(zhǎng)環(huán)境，使得細(xì)胞在三維環(huán)境中生長(zhǎng)。

本品為溶于6mM HAc的無(wú)菌溶液，濃度5mg/ml, 每個(gè)批次產(chǎn)品皆通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)試(包括三維空間培養(yǎng))以保證質(zhì)量的可靠性。

保存：2-8℃保存，不可凍存，有效期一年

運(yùn)輸：冰袋運(yùn)輸

使用說(shuō)明：

一.細(xì)胞培養(yǎng)器皿的表面包被

組織培養(yǎng)器皿的表面包被推薦濃度為1-5μg/cm2，起始濃度可首選5μg/cm2.建議根據(jù)具體細(xì)胞類型來(lái)優(yōu)化。

1.1 6mM HAc稀釋液的制備

本品以溶于6mM HAc (=0.36g/L HAc) 的無(wú)菌溶液形式提供，本身不溶于中性pH,建議用6mM HAc溶液做進(jìn)一步稀釋。

配制方法:取34.5ul冰醋酸 (17.4 M)加入100ml雙蒸水,充分混勻后即得到6mM HAc溶液，0.22um濾膜過(guò)濾除菌后待用。

1.2包被步驟

A.根據(jù)自身實(shí)驗(yàn)體系以及優(yōu)化后的包被濃度來(lái)計(jì)算所需的膠原蛋白量，并加入相應(yīng)孔內(nèi)，確保膠原蛋白溶液完全覆蓋表面。

1) 以包被濃度為5μg/cm2,先用6mM HAc稀釋液將膠原蛋白(5mg/ml) 稀釋到合適的中間濃度，如50μg/ml, 然后參考表1不同培養(yǎng)皿內(nèi)膠原蛋白加量表來(lái)加量到各孔內(nèi);

2)以包被濃度為2ug/cm2,先用6mM HAc稀釋液將膠原蛋白(5mg/ml)稀釋到合適的中間濃度，如12ug/ml, 然后參考表1不同培養(yǎng)皿內(nèi)膠原蛋白加量表來(lái)加量到各孔內(nèi):

表1：不同培養(yǎng)皿內(nèi)膠原蛋白加量表

B.室溫孵育1h,小心吸掉多余液體，用無(wú)菌PBS清洗3~4次后直接使用。或者加完膠原蛋白溶液后，在超凈臺(tái)內(nèi)開(kāi)蓋過(guò)夜晾干。無(wú)菌條件下，包被好的器皿在4-25℃至少可保存3個(gè)月。

二. 三維膠原的制備
    當(dāng)鼠尾膠原蛋白I使用濃度> 1mg/ml, pH 7.0左右皆可形成具有一定強(qiáng)度的三維膠，建議成膠濃度為1-2 mg/ml.
    由于本品是以溶于6mM HAc的無(wú)菌溶液形式提供，在成膠過(guò)程需先加入0.06倍體積的0.1M NaOH中和。

2.1需要溶液準(zhǔn)備(無(wú)菌、 預(yù)冷)
10xPBS (可含酚紅)或10x細(xì)胞培養(yǎng)液
0.1M NaOH
雙蒸水

2.2三維膠原制備(不含細(xì)胞) (以配制1ml, 1mg/ml三 維膠為例) :
a，取200μl膠原蛋白 (5mg/ml) 加到置于冰浴的離心管內(nèi)，加入690uI無(wú)菌水。之后加到12μl 0.1M NaOH [注意:該步驟不能反，如果反過(guò)來(lái)把12μl 0.1M NaOH加到膠原溶液中，會(huì)由于NaOH不能迅速混勻而產(chǎn)生局部的膠原凝結(jié)] , 立即混勻。再加入100μl 10xPBS或10x細(xì)胞培養(yǎng)液，混勻后立即加到培養(yǎng)器皿中[注意:混勻后pH為7.0左右，如果PBS或培養(yǎng)液中沒(méi)有加酚紅，初次使用時(shí)需要用pH試紙測(cè)試]

b，將培養(yǎng)器皿在室溫(25°C左右) 放置20min待膠凝固后，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱內(nèi)。[注意] : 如果配制中使用的是10xPBS,需要在做細(xì)胞培養(yǎng)前，先加入適當(dāng)體積的細(xì)胞培養(yǎng)液預(yù)平衡。

2.3三維膠原制備(含細(xì)胞) (以配制1ml, 1mg/ml三 維膠為例) :

a,準(zhǔn)備好細(xì)胞懸液,并放置于冰浴中。
b，將200μl膠原蛋白(5mg/ml) 加到12μl 0.1M NaOH [注意:該步驟不能反，如果反過(guò)來(lái)把12ul 0.1M NaOH加到膠原溶液中，會(huì)由于NaOH不能迅速混勻而產(chǎn)生局部的膠原凝結(jié)]，立即混勻。再加入23μl 10xPBS或者10x細(xì)胞培養(yǎng)液，立即混勻[注意:混勻后pH為7.0左右，如果PBS或培養(yǎng)液中沒(méi)有加酚紅，初次使用時(shí)需要用pH試紙測(cè)試]。再加入760μl的細(xì)胞懸浮液,混勻后立即加到培養(yǎng)器皿中。
c，將培養(yǎng)器皿在室溫(25°C左右) 放置20min待膠凝固后，加入適當(dāng)體積細(xì)胞培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

注意事項(xiàng)：

1、整個(gè)操作請(qǐng)于冰上進(jìn)行，因室溫鼠尾膠原可迅速成膠，操作過(guò)程盡量保持低溫。

2、整個(gè)操作請(qǐng)?jiān)跓o(wú)瑩環(huán)境下無(wú)瑩操作，避免污染以影響細(xì)胞生長(zhǎng)。

3、為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作

本產(chǎn)品僅供科研使用，不可用于臨床診斷應(yīng)用或其他用途。